ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado
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Percorrer ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado por orientador "Calado, Cecília Ribeiro da Cruz"
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- Comparação da análise morfológica de embriões humanos de processos de procriação medicamente assistida com o perfil molecular do meio de culturaPublication . Santos, Joana de Sousa Emídio dos; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Gallardo, MiguelApesar dos avanços na tecnologia de procedimentos de procriação medicamente assistida (PMA), a taxa de nados vivo em relação ao número de embriões transferidos é ainda bastante baixa. É assim crucial desenvolver uma nova técnica para prever a capacidade de o embrião implantar em relação à técnica convencional de análise da morfologia por microscopia ótica. A nova técnica deve ser não-invasiva, rápida, económica e simples de se aplicar em contexto clínico e, ao mesmo tempo, exceder a capacidade de previsão do método convencional. Neste âmbito, foi avaliada se a análise de meios de cultura in vitro do embrião por espectroscopia de infravermelho médio permitia prever: a morfologia do embrião ao dia 3 e 5 ou 6 de desenvolvimento; ao dia 3 a chegada do embrião a blastocisto; ao dia 5/6 a capacidade de nidificação do embrião. O projeto não interferiu com o procedimento de rotina da clínica de PMA, baseando-se numa análise retrospetiva, que correlacionou a classificação morfológica dos embriões e a eventual gravidez com o espectro do meio de cultura descartado. Utilizaram-se meios de cultura descartados de 123 embriões, obtidos ao dia 3 e ao dia 5 ou 6 de cultura, de 12 pacientes submetidas a tratamentos de PMA de fertilização in vitro ou injeção intracitoplasmática de esperma, utilizando-se óvulos de ciclos a fresco ou vitrificados de dadoras, e de embriões mantidos em cultura individual ou de grupo. Devido a esta grande diversidade de processos de PMA (por exemplo de cultura individual versus em grupo), houve sempre uma reduzida dimensão da amostra, limitando a análise estatística subsequente. Foram avaliados quer os espectros (pré-processados por correção de linha de base e de normalização), quer a 2ª derivada dos espectros. Foi observado uma elevada sensibilidade da análise de espectroscopia do meio de cultura em detetar no espectro variações metabólicas dos diferentes embriões. Por exemplo, foram observadas diferenças espectrais significativas entre embriões obtidos de óvulos não vitrificados e vitrificados. Visualizaram-se regiões espetrais características de embriões de cultura individual com boa e má qualidade ao dia 3 de desenvolvimento, e diferenças na 2ª derivada de espetros de meios de cultura de embriões que implantaram e que não implantaram. Dos estudos efetuados, foi possível identificar razões espectrais que permitiram discriminar a uma significância de 10% a qualidade dos embriões ao dia 3, e da chegada a blastocisto ao dia 5/6. A espectroscopia de infravermelho médio revela-se assim muito promissora para avaliar o estado metabólico do embrião.
- Desenvolvimento de dispositivos em aço inoxidável por fabrico aditivo, para aplicação ortopédicaPublication . Casimiro, Pedro Tomás Alvarez Ferreira; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Rodrigues, Maria Alexandra Sousa; Gouveia, Bárbara Perry AlvesCom o crescente interesse na tecnologia de fabrico aditivo, a avaliação da biocompatibilidade e das propriedades mecânicas dos materiais para aplicações médicas tornou-se crucial. Este estudo teve como objetivo investigar as propriedades mecânicas e a citotoxicidade de estruturas porosas giroide, honeycomb e triangular concebidas para potenciais aplicações ortopédicas. As estruturas foram fabricadas utilizando a tecnologia de fabrico por filamento fundido de metal (FFF) a partir de um filamento BASF Ultrafuse 316L. Este estudo demonstrou a importância e o impacto do design e da densidade das peças nas propriedades mecânicas das estruturas e na sua viabilidade celular. As estruturas que combinaram as melhores propriedades mecânicas e de biocompatibilidade foram as de preenchimento baixo e sem paredes, como a giroide 35% e a honeycomb 35%. Estas estruturas apresentaram tensões de cedência e módulos de elasticidade próximos dos requisitos mecânicos para o osso cortical e mantiveram boa viabilidade celular, com menor formação de resíduos.
- Development of Predictive Models for COVID-19 Prognosis based on Patients’ Demographic and Clinical DataPublication . Von Rekowski, Cristiana; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Pinto, Iola; Bento, LuísBackground – Cases of infection by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) were first reported in late December 2019. Due to the large spectrum of clinical presentations and outcomes, the disease was named Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) and characterized as a pandemic due to the elevated number of cases worldwide, the high transmission rate and the lack of action measures. Since then, a lot of progress has been made, but the study of demographic and clinical information and the determination of possible laboratory biomarkers for COVID-19 prognosis is crucial. Purpose – Determine predictive biomarkers for COVID-19’s outcome (death or survival), in critically ill patients, using clinical, demographic and laboratory data from the intensive care unit (ICU). Methods – Demographic, clinical and laboratory data from 337 COVID-19 patients admitted to the ICU of Centro Hospitalar Universitário Lisboa Central, Portugal, between March 2020 and March 2021, was extracted from the hospital’s electronic medical record system, pre-processed, and analyzed. Comparisons were made regarding death, the need of invasive mechanic ventilation (IMV), the first three COVID-19 waves and age groups. Longitudinal data was gathered over the course of the patients stay in the ICU. To infer about the evolution of the patients' condition in the first week of ICU admission, a comparative analysis was carried out between the data from the 2nd (335 patients) and 7th days (216 patients). Comparisons of laboratory parameters between discharged and deceased patients, at these time points were performed. The associations between the several biomarkers and death were tested by means of Univariate Generalized Estimating Equations (GEEs) models. Additionally, to analyze the impact of some biomarkers in mortality, crude odds ratios were estimated and interpreted, with the corresponding 95% confidence intervals (CIs). Death event-free survival rates were obtained by the Kaplan-Meier estimator. All P values were considered statistically significant at P<0.05. Results – Deceased patients were considerably older, had more comorbidities, required more IMV, and spent less time in the hospital than discharged patients. Death rates did not differ significantly between COVID-19 waves. Patients from the 1st wave were significantly older and relied more on IMV and extracorporeal membrane oxygenation (ECMO). Most of the detected differences regarding laboratory biomarkers were found between discharged and deceased patients from the 2nd and 3rd waves, being that the deceased ones had almost always worse results. In general, worse results were obtained in the 1st wave and in the 7th day of ICU admission. In 2nd day of ICU admission, 2nd wave, higher mortality rates were observed for patients with lymphocyte (LYM) levels under normality ranges. In the 3rd wave, mortality rates were higher for patients with high sensitivity troponin I (hs-cTn I) levels above normality ranges in the 2nd day of ICU admission, with LYM levels under normality ranges in the 7th day of ICU admission, and with platelet (PLT) levels below normality ranges, either in the 2nd or 7th days of ICU admission. Through the univariate logistic regression’s results in 2nd day of ICU admission, 2nd wave, hs-cTn I, red blood cell (RBC) counts, platelet-lymphocyte ratio (PLR) and neutrophil-lymphocyte ratio (NLR) showed significant association with the risk of death. In 7th day of ICU admission, C-reactive protein (CRP), RBC counts, hematocrit (HCT), hemoglobin (HGB), white blood cell (WBC) and neutrophil (NEU) counts, eosinophil (EO) counts and NLR, revealed significant association with the risk of death. In the 2nd day of ICU admission, 3rd wave, hs-cTn I, PLT counts, lactate dehydrogenase (LDH) and CRP showed significant association with the risk of death. For the 7th day, PCT, CRP, WBC and NEU counts, LYM counts, NLR and PLT counts results were also associated with higher risks of death. Univariate GEEs models results demonstrated that, in the 1st wave, hs-cTn I, myoglobin, EO counts, results were associated with higher risks of death. In the 2nd wave, the risk of death was significantly associated with hs-cTn I, myoglobin levels, EO counts, WBC and NEU counts, LYM counts, and INR. Finally, in the 3rd wave, hs-cTn I, CK, EO counts, WBC and NEU counts, LYM counts, NLR and PLT counts, were also associated with the risk of death. Conclusion - This study provides useful information for prognostic evaluation that can be used to guide treatment and monitoring. Most importantly, it consists of valuable data that can be employed as the foundation of a variety of future research. Aside from the positive results, more research is needed to develop reliable and robust biomarkers for COVID-19’s outcomes.
- Development of tissue-engineered temporomandibular discs based on xenogeneic extracellular matricesPublication . Trindade, Daniela Alexandra Pinheiro; Moura, Carla Sofia Monteiro de; Calado, Cecília Ribeiro da CruzThe temporomandibular joint (TMJ) disc is a fibrocartilaginous tissue that supports and lubricates the joint. Due to this important feature and the fact that presents low intrinsic regeneration capacity, is highly predisposed to suffering traumatic injuries or degeneration, including all structures of the joint. In more advanced cases of disc dysfunction, its total removal is essential to decrease pain and increase oral function. However, a substitute is needed for joint stabilization, correct dental occlusion and to prevent degeneration in the remaining bone structures. Some attempts in the field of tissue engineering to find a suitable substitute have been done, but the research persists. Interest in decellularized xenogeneic tissues has been increasing, so the present study has focused on developing a potential TMJ disc based on the decellularization of lamb discs. To this end, different decellularization protocols were evaluated by testing different agents/concentrations, such as solvents (ethanol/acetone), detergents (sodium dodecyl sulfate and Triton X-100) and enzymes (accutase). A physical method (one cycle of freeze and thaw) was also combined with the two detergents. A complete analysis of the morphology (weight, thickness and mediolateral and anteroposterior dimensions) and compression tests of the native and acellular discs were performed to evaluate if there were changes in the properties of the disc. Univariate and multivariate analyses by Fourier transform infrared spectroscopy were applied to assess the impact of the decellularization agents on the extracellular matrix (ECM) components, such as collagen and glycosaminoglycans (GAGs). Moreover, scanning electron microscope and micro-computed tomography allowed the visualization of the morphology of the disc, enabling the evaluation of the ECM and the removal of complete cell content. Through this thesis it was possible to carry out a preliminary study in which different methods of decellularization were evaluated, where experiments showed that the combination of freezing and thawing followed by 0.1% Triton X-100 leads to the complete cell removal, preservation of morphology and mechanical behaviour, while collagen and GAGs are minimally affected. Future studies are proposed for the optimization of this protocol such as the implementation of more freeze and thaw cycles and the combination with accutase enzyme.
- Effect of mesenchymal stem cell source on the molecular profile of extracellular vesicles for cell therapyPublication . Pires, Filipa Adriana Rego; Platzgummer, Ana Margarida Pires Fernandes; Calado, Cecília Ribeiro da CruzMesenchymal stem cells (MSCs) obtained from different sources have been considered for cell therapeutics against several diseases, were its derived extracellular vesicles (EVs) are the primary mediators of the cells paracrine effect. The present work aimed to evaluate the influence of different MSC sources, as adipose tissue, bone marrow and umbilical cord matrix on the molecular profile of EVs acquired by Fourier-Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy after spectra pre-processing and its principal component and hierarchical cluster analysis. It was evaluated the EVs, MSCs and conditioned media molecular profiles in function of MSC source, MSC donor (i.e. 3 donors per source) and media composition (xenogeneic-free (XF) vs serum-containing medium (DMEM-FBS)). Two replicates cultures per donor were considered. EVs were obtained from the MSC conditioned media based on a kit assay using a polymer that, however, absorbs on the EVs surface leading to an interference on the EVs spectra signal. The EVs high dilution factor leads to the polymer partial desorption, as observed by other authors. Due to variability of the desorption process, a lower reproductible spectra from EVs were obtained. Despite that, it was possible to observe that EVs molecular profile depended on the media type and, for each MSC source, on the MSC donor. It was also observed that EVs molecular profile obtained from DMEM cultures apparently presented a more homogenous chemical profile than EVs obtained with XF medium. Diverse ratios between infrared spectral bands were identified, that discriminate at a 5% significance, in mean terms, the EVs molecular profile in function of the culture medium composition. The MSC spectra were also highly variable due to different growth patterns. Even so, it was possible to observe that MSC molecular profile depended on the culture media type, being observed a more homogeneous molecular profile when cells were cultured in XF than in DMEM medium. When grown on DMEM medium, it was possible to observe that MSC molecular profile depended on the MSC source. MSC molecular profile also apparently depended on the MSC donor. A very similar conditioned media spectra were obtained from the different cultures and, consequently, higher reproducible molecular profiles were obtained in relation to MSC and EVs analyses. It was observed that conditioned media molecular profile depended on MSC source, MSC donor and culture media composition. A lower variable molecular profile was observed when using XF medium, as observed with MSC molecular profile. From the EVs, MSC and conditioned media molecular profiles, the best reproductive results were obtained from the conditioned media, that pointed that it was affected by the MSC donor and source. The impact of the culture media type, MSC source and donor was also partially observed on the EVs and MSC molecular profile. All these results point to the impact of the culture media, MSC source and donor on the EVs molecular profile. Therefore, in therapies-cell based and based EVs-based, the impact of culture media, MSC source and donor should be considered.
- Heparin functionalization of fibrin hydrogels for tissue engineeringPublication . Ramalho, Jéssica Reais; Malheiro, Afonso de Botelho Ferreira Braga; Calado, Cecília Ribeiro da CruzA engenharia de tecidos constitui uma elevada promessa para a completa restauração de tecidos e de órgãos danificados, podendo assim mudar o paradigma da medicina atual. Sendo a base da medicina regenerativa, possui o intuito de revolucionar as formas de melhorar a saúde e a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo, restaurando, mantendo ou melhorando a função dos tecidos e órgãos. Devido ao seu elevado potencial, são já numerosos os exemplos de aplicações publicados, quer em revistas científicas quer nos meios de comunicação normais. De realçar que esta é uma área multidisciplinar com vertentes sociais, económicas, ambientais e éticas, necessitando, portanto, de equipas de profissionais interdisciplinares como da medicina, biologia, química, física, ciências dos materiais, computacionais e de engenharias. Nas últimas décadas, a engenharia de tecidos tem-se debruçado sobre o desenvolvimento de substitutos capazes de simular histológica, fisiológica e morfologicamente o tecido humano. Esta necessidade surgiu devido à procura de suportes eficazes e seguros para reparação e regeneração de vários tecidos e órgãos vitais; assim como a carência de modelos adequados dos sistemas do corpo humano. Os modelos animais tradicionalmente utilizados para suprimir esta última necessidade não permitem mimetizar com precisão as principais características das patologias humanas, em grande parte devido às diferenças entre as espécies. Em adição, não é possível a aplicação deste tipo de modelos em plataformas de “high-throughput”, que permitem testar, em paralelo e com rapidez, centenas a milhares de compostos para identificação e seleção dos mais promissores, reduzindo os custos e duração dos ensaios clínicos. Desta forma, o desenvolvimento de novos modelos celulares que mimetizem o tecido humano e patologias associadas de forma mais precisa tem ganho elevado interesse. Tendo como objetivo mimetizar in vitro as características de tecidos humanos, é fundamental ter em conta a organização celular tridimensional (3D) do tecido. Esta configuração 3D deverá permitir a regulação de parâmetros como a disponibilidade de nutrientes ou fatores de crescimento, o stress mecânico induzido pelo sistema de cultura, as interações célula-célula e célula-matriz extracelular, entre outros; pois terá um impacto direto na ativação e direcionamento das vias de diferenciação e funcionalidade celular, conferindo uma maior similaridade entre o modelo e o tecido in vivo. Com este propósito, têm sido desenvolvidos sistemas com um maior nível de complexidade, em comparação com as tradicionais culturas em monocamada de células. Entre os sistemas mais utilizados encontram-se as culturas in vitro 3D, em que a estratégia passa pela encapsulação das células em matrizes. Estes modelos 3D poderão assim atingir, a longo prazo, a substituição da técnica tradicional de transplantação de órgãos e tecidos, permitir a diminuição da dependência sobre a utilização de modelos animais, e contribuir fortemente para o desenvolvimento de ensaios mais precisos para a avaliação e identificação de novos fármacos, apresentando-se, desta forma, como uma alternativa complementar tanto para a investigação como para a indústria. No entanto, um dos maiores desafios em engenharia de tecidos é a vascularização e a inervação de tecidos, que permitam o real funcionamento a médio e longo prazo dos tecidos/ órgãos. Para tal, é necessário compreender os desafios relacionados, por exemplo, com a fabricação de uma rede tridimensional funcional de tecidos que permita uma perfusão e difusão adequada para uma boa disponibilização de nutrientes e de oxigénio, para o normal crescimento, diferenciação e proliferação celular. É assim crucial o desenvolvimento de modelos/microambientes 3D envolvendo células, e/ou fatores de crescimento, e que simulem e permitam o teste de biomateriais quanto às suas características vasculares mecânicas, endoteliais e anti-trombogénicas. Para abordar este desafio, o objetivo desta tese foi melhorar as características de um material, que envolvia a conjugação de fibrina com heparina (HCF) e a inclusão de microcanais num hidrogel para aplicações neurais e vasculares. A melhoria de hidrogéis pré-existentes e a adição de microcanais podem promover suportes adequados para engenharias de tecido neural e vascular. Os hidrogéis são polímeros que através de ligações cruzadas formam uma rede tridimensional hidrofílica de cadeias poliméricas e que absorvem uma quantidade considerável de solvente, devido à sua forte afinidade com a água e com a maioria das soluções aquosas. São considerados materiais fortemente hidratados e são aplicados na regeneração de tecidos como substitutos da matriz extracelular. A sua importância deve-se à semelhança das suas propriedades físicas com as dos tecidos in vivo, tais como o elevado conteúdo em água, consistência macia e elástica, e baixa tensão superficial. A fibrina foi o material selecionado de forma a constituir a estrutura suporte do modelo 3D devido à possibilidade de se ajustar a morfologia, propriedades mecânicas e estabilidade do hidrogel controlando a sua concentração. Para além disso, a fibrina é biocompatível, a sua taxa de degradação é controlável e os produtos de degradação não são tóxicos. Quanto à escolha da funcionalização do hidrogel com heparina (HCF, Heparin-conjugated fibrinogen), esta foi devido à elevada afinidade da heparina por fatores de crescimento como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento neural (NGF). A retenção destes fatores pode promover um ambiente ideal para a adesão, migração, orientação e proliferação de células. Para efetuar o estudo do comportamento de células no hidrogel, foram incorporados tenócitos, fibroblastos alongados e especializados do tendão. A sua importância deve-se aos fibroblastos serem células que residem dentro da matriz extracelular de vários tecidos conjuntivos, e que são críticos para a síntese e reparação da matriz. Em resposta a lesões e durante o crescimento tumoral, os fibroblastos são ativados e reconhecidos como miofibroblastos, células de cicatrização de feridas que reparam o tecido danificado através da secreção de colagénio, fibronectina, proteoglicanos, fatores de crescimento do tecido conjuntivo, entre outras proteínas e enzimas. Como sintetizadores e modificadores da matriz extracelular, os fibroblastos também desempenham um papel fundamental no crescimento nervoso e na angiogénese. A angiogénese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura existente. O processo ocorre em condições fisiológicas, como por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e cicatrização de feridas; e em condições patológicas, como por exemplo, durante o crescimento tumoral. O processo envolve a ligação de fatores de crescimento como o VEGF, importantes para a proliferação, migração e diferenciação de células, promovendo a formação de novos vasos sanguíneos. O electrospinning foi o método escolhido para a fabricação das microfibras, uma vez que este processo permite obter razões elevadas de área superficial por volume, dimensão de poros adequados às dimensões das células, funcionalização de superfícies e múltiplos locais para interação e conexão celular, e reduzida limitação de fenómenos de transferência de massa. As microfibras foram baseadas em poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM), um polímero termorresistente, mas que apresenta uma temperatura de solução crítica (LCST) de 32°C. Esta característica permite a incorporação das microfibras no HCF e a sua subsequente remoção, originando micro-canalizações. Neste âmbito, é fabricado um hidrogel otimizado com microcanais, o qual pode constituir um modelo biomimético funcional e viável para a promoção de vascularização e de inervação de tecidos. Para alcançar este objetivo, o presente trabalho englobou: (1) o processo de design, fabricação e caracterização do hidrogel, (2) seeding do hidrogel com tenócitos para testar comportamentos celulares e (3) fabricação de microfibras pNIPAM para criação dos microcanais no hidrogel. Das experiências realizadas observou-se que foi possível ativar e ligar a heparina ao fibrinogénio. Também foi observado que o tempo de gelificação dos hidrogéis aumenta com o aumento da concentração de fibrina conjugada com heparina. Observaram-se dificuldades de polimerização aquando da utilização de 40%, 50%, 75% e 100% de concentração de HCF. Através de análises com o corante azul de dimetilmetileno e de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), quantificou-se a heparina e o fator de crescimento VEGF-A dentro do gel e da sua libertação entre 5 e 7 dias, respetivamente. Observou-se que os hidrogéis conseguem reter quer heparina quer VEGF-A. Nos estudos 2D e 3D de incorporação de tenócitos nos hidrogéis de HCF, observou-se a adesão das células em hidrogéis com concentrações de 10%, 35% e 50% de HCF. As melhores configurações de diâmetro e de alinhamento de fibras foram obtidas por electrospinning com fibras de 50% pNIPAM em clorofórmio/DMF numa razão de 7:3, bem como de 40% pNIPAM em clorofórmio/DMF numa razão de 3:1. Em termos de perspetivas futuras, sugere-se a continuação da otimização do processo de formação dos hidrogéis de HCF de forma a minimizar as dificuldades de polimerização observadas. Também se sugere uma melhor caracterização dos hidrogéis, especialmente em situações de incorporação de células. Em suma, espera-se que os resultados obtidos no presente trabalho contribuam para o desenvolvimento de modelos biomiméticos neuronais e vasculares, singulares ou combinados, para estudos in vitro e aplicações regenerativas.
- Impact of centrosome amplification in the malignant transformation of Barrett’s esophagusPublication . Silveira, Bárbara Nunes de Amaral da Silva; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Lopes, Carla Alexandra MendesAbstract Barrett's esophagus (BE) is a multistep premalignant condition, progressing from metaplasia, dysplasia, to, ultimately, esophageal adenocarcinoma (EAC).BE early detection, as well as stratifying its risk of progression, is becoming a growing concern. Centrosome amplification (CA) is observed in metaplastic BE cells and increases throughout progression, significantly increasing from metaplasia to dysplasia. Because CA has been described in many human cancers and may contribute to the development of malignancy, we hypothesized that CA may contribute to BE malignant progression by impacting the migration and invasion potentials of BE dysplastic cells. If this hypothesis is correct, a decrease of CA in dysplasia would be sufficient to reduce malignant properties such as invasiveness potential. Indeed, by depleting molecules of centriolar biogenesis to reduce the level of CA, we observed a reduced migratory and invasive potential of dysplastic cells. As epithelial-mesenchymal transition (EMT) is often linked to malignancy and invasion capacity, we investigated whether the reduction of extra centrosomes could result in an EMT reversal, increasing epithelial cellular traits and lessening mesenchymal features responsible for the migratory and invasive potential of the cells. Although the reduction of CA in dysplasia cells was not accompanied by significant changes in their EMT signature, there was a cytosolic accumulation of a component of the extracellular matrix. Notably, this was accompanied by reduced levels of this component in the extracellular space. In summary, our results indicate that CA contributes to the invasive potential in dysplasia and provides important clues into their mechanisms. This study provides new insights regarding the contribution of supernumerary centrosomes to the invasive potential in dysplasia, highlighting the importance of CA in the malignant progression of BE. These findings may contribute to the development of new biomarkers of progression and personalizing therapy.
- Impact of Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the molecular profile of plasma and serumPublication . Araújo, Rúben Alexandre Dinis; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Ribeiro, EdnaBackground and Goals: Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) is the major catechin present in green tea and it is known to display diverse biological activities as antioxidation, antiinflammation, antiproliferation, antimicrobial, antiviral, among others. The present work aimed to evaluate the impact of consumption of EGCG on the molecular profile of human serum and plasma. Methods: The effect of the consumption of a daily intact of 225 mg for 90 days of EGCG on healthy human volunteers (n = 30), on the plasma and serum molecular profile was evaluated by mid-infrared spectroscopy (MIRS). A method to search for biomarkers in human plasma and serum was developed based on MIRS and machine learning methods. Results: It was observed through different unsupervised pattern search methods and classification supervised methods, e.g. Principal Component Analysis (PCA), Partial Least Squares Regression (PLSR), Discriminant Analysis (DA), Hierarchical Cluster Analysis (HCA) that, both plasma and serum samples presented a significantly different molecular profile after the 90 days of EGCG consumption. Based on loadings, the regions of the spectra with the most impact into cluster separation between 90 days were analysed and it was observed that EGCG consumption affected the profile of major molecules as proteins and lipids. Diverse absorbance ratios were identified as being statistically different (p < 0.01) after EGCG consumption, revealing a high impact of EGCG on human general metabolism. Conclusions: MIRS enabled to monitor the drastic change of the molecular profile of serum and plasma after 90 days of EGCG consumption. MIRS allowed to attain the molecular profile of the sample in a sensitive and specific mode, but also in an economic, simple, rapid and high throughput way. The technique, when combined with automatic methods of pattern recognition, classification and biomarkers search, results in a highly innovative and promising method to acquire information in large-scale epidemiological studies towards a better understanding of the in vivo effect of EGCG.
- Mechanisms and effects of cell density of embryos in culture in in vitro fertilization processes in embryonary developmentPublication . Ribeiro, Inês Barradas; Molina, Miguel Gallardo; Calado, Cecília Ribeiro da CruzBackground and Objectives: The objective of achieving higher pregnancy rates in the area of human reproduction has promoted the search for new insights that could lead to a better embryonic development. The culture of embryos in groups aims to promote embryotrophic interaction, mediated by the secretion of paracrine and autocrine factors that induce mutual embryonic development, being crucial to evaluate the presence of factors that lead this evolution to fully understand the process. The present study aimed to explore what crucial knowledge could be obtained for the medically assisted reproduction area through the use of mid-infrared spectroscopy in the analysis of culture media spent by murine embryos and to evaluate retrospectively ovodonation cycle data for evaluation of the benefit of group human embryo culture (CG) versus individual culture (IC). In this way, it would be possible to take a position regarding the theory of the benefit of group culture and to understand whether the FTIR spectroscopy tool would be useful in evaluating the spectral profile of media spent by embryos. Methods: This thesis is divided in three distinct methodological chapters: I) the analysis and comparison of the FTIR spectral profile of different commercial human embryo culture media. In order to increase the accuracy of this tool, pre-processing methods were carried out as atmospheric and baseline correction, normalizations and derivatives that minimize distortions and resolve overlapping bands. II) the analysis of the spectral profile of spent culture media of grouped murine embryos: the molecular profile of 47 culture media spent by murine embryos up to the state of two cells was studied, with a density variation between 3 to 114 embryos per drop were evaluated before and after fertilization. III) the retrospective analysis to assessthe impact of group culture on human embryonic development rates using data from Ginemed’s IVF unit: An analysis was performed on each ovodonation cycle to compare the results of individually culture embryos and those culture in groups. Results: In chapter I), it was observed through the pattern recognition method of Principal Component Analysis (PCA) and the pre-processing methods applied that FTIR spectroscopy is sensitive enough to recognize different molecular profiles between culture media, highlighting differences at aminoacids (aa) and lipids molecules. In chapter II), The analysis of culture media spent of murine embryos showed different spectral profiles between media analyzed individually, without being able to establish any link between variables (species, number of embryos, pre/post fertilization). In chapter III), the retrospective comparison of culture of human embryos in individual and groups, revealed similar developmental rates to the blastocyst stage between both strategies; i.e. it was not detected a positive effect of group culture. Conclusions: The FTIR spectroscopy enables to acquire the molecular profile of human embryo culture media. Despite this, it was not possible to acquire by PCA of spectral data of spent media from the murine embryos patterns associated to species, number of embryos, etc. In the human embryo population and conditions evaluated it was not possible to observe advantages of culture the embryos in group in relation to culture embryos individually. It is proposed as future work, to evaluate other spectral processing techniques and increase the dimension of the human embryos evaluated.
- Pesquisa de biomarcadores de genotoxicidade em sangue e soro por espectroscopia de infravermelho por transformada de FourierPublication . Teixeira, Helder Santos da Paz; Calado, Cecília Ribeiro da Cruz; Ladeira, CarinaOs biomarcadores de genotoxicidade têm sido amplamente utilizados na avaliação da exposição ambiental de trabalhadores a por exemplo agentes citostáticos, sendo estes geralmente determinados por análise de micronúcleos em linfócitos após bloqueio da citocinese. Devido à laboriosidade e complexidade desta técnica, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver um método de pesquisa de biomarcadores de genotoxicidade no sangue por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR – Fourier-Transform Infrared spectroscopy), dado esta última técnica ser muito sensível a diferenças na constituição molecular de amostras biológicas, e em simultâneo ser baseada num protocolo experimental simples de implementar, rápido, económico e aplicável em análises de elevado débito. No presente trabalho, foram consideradas amostras de sangue congelado de 92 pessoas, sendo 46 profissionais em hospitais exposto ao citostático 5-fluorouracil, identificados como Grupo Casos, e os restantes 46 participantes, profissionais que não trabalham em ambiente hospitalar e que não foram expostos ao agente citostático, identificados como Grupo Controlo. Para além destas amostras, estavam disponíveis dos mesmos participantes soro de 23 pessoas do grupo Casos e 35 do grupo Controlo. Foi avaliado o efeito da centrifugação, grau de diluição e solução de diluição do sangue após descongelação na razão sinal/ruído do espectro de FTIR. Foi também avaliado o efeito do grau de diluição de soro. Pesquisou-se biomarcadores espectrais em amostras de sangue total, soro e de extratos de metanol de sangue, através da avaliação do efeito de diversos pré-processamento de espectros (correção de linha de base, normalização, 1ª e 2ª derivada) na análise de componentes principais. Para estes 3 tipos de amostras, pesquisaram-se bandas espectrais que fossem diferentes na média da 2ª derivada dos espectros de Casos e Controlo. Com base nas diferenças observadas na 2ª derivada do espectro, e no trabalho de outros investigadores, avaliaram-se estatisticamente diversas razões de bandas espectrais. Não foi possível identificar razões de bandas dos espectros de soro estatisticamente diferentes entre as médias das populações de Casos e Controlos. Foi possível identificar nas amostras de sangue total e de extratos de metanol de sangue, diversas razões de bandas dos espectros significativamente diferentes entre as médias das populações de Casos e Controlos. Desta forma o método de espectroscopia FTIR desenvolvido neste trabalho pode constituir uma ferramenta relevante na pesquisa de biomarcadores de genotoxicidade em amostras biológicas como de sangue, e por consequência uma ferramenta no combate ao cancro.