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Authors
Abstract(s)
A engenharia de tecidos constitui uma elevada promessa para a completa restauração de tecidos e de órgãos danificados, podendo assim mudar o paradigma da medicina atual. Sendo a base da medicina regenerativa, possui o intuito de revolucionar as formas de melhorar a saúde e a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo, restaurando, mantendo ou melhorando a função dos tecidos e órgãos. Devido ao seu elevado potencial, são já numerosos os exemplos de aplicações publicados, quer em revistas científicas quer nos meios de comunicação normais. De realçar que esta é uma área multidisciplinar com vertentes sociais, económicas, ambientais e éticas, necessitando, portanto, de equipas de profissionais interdisciplinares como da medicina, biologia, química, física, ciências dos materiais, computacionais e de engenharias.
Nas últimas décadas, a engenharia de tecidos tem-se debruçado sobre o desenvolvimento de substitutos capazes de simular histológica, fisiológica e morfologicamente o tecido humano. Esta necessidade surgiu devido à procura de suportes eficazes e seguros para reparação e regeneração de vários tecidos e órgãos vitais; assim como a carência de modelos adequados dos sistemas do corpo humano. Os modelos animais tradicionalmente utilizados para suprimir esta última necessidade não permitem mimetizar com precisão as principais características das patologias humanas, em grande parte devido às diferenças entre as espécies. Em adição, não é possível a aplicação deste tipo de modelos em plataformas de “high-throughput”, que permitem testar, em paralelo e com rapidez, centenas a milhares de compostos para identificação e seleção dos mais promissores, reduzindo os custos e duração dos ensaios clínicos. Desta forma, o desenvolvimento de novos modelos celulares que mimetizem o tecido humano e patologias associadas de forma mais precisa tem ganho elevado interesse.
Tendo como objetivo mimetizar in vitro as características de tecidos humanos, é fundamental ter em conta a organização celular tridimensional (3D) do tecido. Esta configuração 3D deverá permitir a regulação de parâmetros como a disponibilidade de nutrientes ou fatores de crescimento, o stress mecânico induzido pelo sistema de cultura, as interações célula-célula e célula-matriz extracelular, entre outros; pois terá um impacto direto na ativação e direcionamento das vias de diferenciação e funcionalidade celular, conferindo uma maior similaridade entre o modelo e o tecido in vivo. Com este propósito, têm sido desenvolvidos sistemas com um maior nível de complexidade, em comparação com as tradicionais culturas em monocamada de células. Entre os sistemas mais utilizados encontram-se as culturas in vitro 3D, em que a estratégia passa pela encapsulação das células em matrizes. Estes modelos 3D poderão assim atingir, a longo prazo, a substituição da técnica tradicional de transplantação de órgãos e tecidos, permitir a diminuição da dependência sobre a utilização de modelos animais, e contribuir fortemente para o desenvolvimento de ensaios mais precisos para a avaliação e identificação de novos fármacos, apresentando-se, desta forma, como uma alternativa complementar tanto para a investigação como para a indústria. No entanto, um dos maiores desafios em engenharia de tecidos é a vascularização e a inervação de tecidos, que permitam o real funcionamento a médio e longo prazo dos tecidos/ órgãos. Para tal, é necessário compreender os desafios relacionados, por exemplo, com a fabricação de uma rede tridimensional funcional de tecidos que permita uma perfusão e difusão adequada para uma boa disponibilização de nutrientes e de oxigénio, para o normal crescimento, diferenciação e proliferação celular. É assim crucial o desenvolvimento de modelos/microambientes 3D envolvendo células, e/ou fatores de crescimento, e que simulem e permitam o teste de biomateriais quanto às suas características vasculares mecânicas, endoteliais e anti-trombogénicas. Para abordar este desafio, o objetivo desta tese foi melhorar as características de um material, que envolvia a conjugação de fibrina com heparina (HCF) e a inclusão de microcanais num hidrogel para aplicações neurais e vasculares. A melhoria de hidrogéis pré-existentes e a adição de microcanais podem promover suportes adequados para engenharias de tecido neural e vascular.
Os hidrogéis são polímeros que através de ligações cruzadas formam uma rede tridimensional hidrofílica de cadeias poliméricas e que absorvem uma quantidade considerável de solvente, devido à sua forte afinidade com a água e com a maioria das soluções aquosas. São considerados materiais fortemente hidratados e são aplicados na regeneração de tecidos como substitutos da matriz extracelular. A sua importância deve-se à semelhança das suas propriedades físicas com as dos tecidos in vivo, tais como o elevado conteúdo em água, consistência macia e elástica, e baixa tensão superficial. A fibrina foi o material selecionado de forma a constituir a estrutura suporte do modelo 3D devido à possibilidade de se ajustar a morfologia, propriedades mecânicas e estabilidade do hidrogel controlando a sua concentração. Para além disso, a fibrina é biocompatível, a sua taxa de degradação é controlável e os produtos de degradação não são tóxicos. Quanto à escolha da funcionalização do hidrogel com heparina (HCF, Heparin-conjugated fibrinogen), esta foi devido à elevada afinidade da heparina por fatores de crescimento como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento neural (NGF). A retenção destes fatores pode promover um ambiente ideal para a adesão, migração, orientação e proliferação de células. Para efetuar o estudo do comportamento de células no hidrogel, foram incorporados tenócitos, fibroblastos alongados e especializados do tendão. A sua importância deve-se aos fibroblastos serem células que residem dentro da matriz extracelular de vários tecidos conjuntivos, e que são críticos para a síntese e reparação da matriz. Em resposta a lesões e durante o crescimento tumoral, os fibroblastos são ativados e reconhecidos como miofibroblastos, células de cicatrização de feridas que reparam o tecido danificado através da secreção de colagénio, fibronectina, proteoglicanos, fatores de crescimento do tecido conjuntivo, entre outras proteínas e enzimas. Como sintetizadores e modificadores da matriz extracelular, os fibroblastos também desempenham um papel fundamental no crescimento nervoso e na angiogénese. A angiogénese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasculatura existente. O processo ocorre em condições fisiológicas, como por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário e cicatrização de feridas; e em condições patológicas, como por exemplo, durante o crescimento tumoral. O processo envolve a ligação de fatores de crescimento como o VEGF, importantes para a proliferação, migração e diferenciação de células, promovendo a formação de novos vasos sanguíneos. O electrospinning foi o método escolhido para a fabricação das microfibras, uma vez que este processo permite obter razões elevadas de área superficial por volume, dimensão de poros adequados às dimensões das células, funcionalização de superfícies e múltiplos locais para interação e conexão celular, e reduzida limitação de fenómenos de transferência de massa. As microfibras foram baseadas em poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM), um polímero termorresistente, mas que apresenta uma temperatura de solução crítica (LCST) de 32°C. Esta característica permite a incorporação das microfibras no HCF e a sua subsequente remoção, originando micro-canalizações. Neste âmbito, é fabricado um hidrogel otimizado com microcanais, o qual pode constituir um modelo biomimético funcional e viável para a promoção de vascularização e de inervação de tecidos. Para alcançar este objetivo, o presente trabalho englobou: (1) o processo de design, fabricação e caracterização do hidrogel, (2) seeding do hidrogel com tenócitos para testar comportamentos celulares e (3) fabricação de microfibras pNIPAM para criação dos microcanais no hidrogel.
Das experiências realizadas observou-se que foi possível ativar e ligar a heparina ao fibrinogénio. Também foi observado que o tempo de gelificação dos hidrogéis aumenta com o aumento da concentração de fibrina conjugada com heparina. Observaram-se dificuldades de polimerização aquando da utilização de 40%, 50%, 75% e 100% de concentração de HCF. Através de análises com o corante azul de dimetilmetileno e de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), quantificou-se a heparina e o fator de crescimento VEGF-A dentro do gel e da sua libertação entre 5 e 7 dias, respetivamente. Observou-se que os hidrogéis conseguem reter quer heparina quer VEGF-A. Nos estudos 2D e 3D de incorporação de tenócitos nos hidrogéis de HCF, observou-se a adesão das células em hidrogéis com concentrações de 10%, 35% e 50% de HCF. As melhores configurações de diâmetro e de alinhamento de fibras foram obtidas por electrospinning com fibras de 50% pNIPAM em clorofórmio/DMF numa razão de 7:3, bem como de 40% pNIPAM em clorofórmio/DMF numa razão de 3:1. Em termos de perspetivas futuras, sugere-se a continuação da otimização do processo de formação dos hidrogéis de HCF de forma a minimizar as dificuldades de polimerização observadas. Também se sugere uma melhor caracterização dos hidrogéis, especialmente em situações de incorporação de células. Em suma, espera-se que os resultados obtidos no presente trabalho contribuam para o desenvolvimento de modelos biomiméticos neuronais e vasculares, singulares ou combinados, para estudos in vitro e aplicações regenerativas.
One of the greatest challenges encountered in Tissue Engineering (TE) has been the vascularization and innervation of tissues, which allow the medium to long-term functioning of the tissues/ organs. To address this challenge, the goal of this thesis was to optimize the characteristics of a material, involving the conjugation of heparin to fibrin and inclusion of pNIPAM micro-channels in a hydrogel for neural and vascular applications. Improvement of pre-existing hydrogels and the addition of microchannels may promote suitable supports for neural and vascular TE. Experiments towards the optimization and characterization of heparin-conjugated fibrin (HCF) hydrogels (with gelation kinetics study, alcian blue staining, heparin quantification and VEGF-A release profile), tenocytes seeding to test cell behavior, and fabrication of pNIPAM microfibers for hydrogel microchanneling were conducted. It was observed that it was possible to activate and bind heparin to fibrinogen. It was also observed that the gelation time of the hydrogels increases with increasing concentration of fibrin conjugated with heparin. Polymerization difficulties were observed when using 40%, 50%, 75% and 100% HCF concentration. Through dimethylmethylene blue dye and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assays, heparin and VEGF-A growth factor were quantified within the gel and delivered in 5-7 days. It was observed that the hydrogels can retain either heparin or VEGF-A. In the 2D and 3D studies of tenocyte incorporation in HCF hydrogels, cell adhesion was observed in hydrogels at concentrations of 10%, 35% and 50% of HCF. The best diameter and fiber alignment configurations were obtained by electrospinning with 50% pNIPAM fibers in chloroform/ DMF in a ratio of 7:3, as well as 40% pNIPAM in chloroform/ DMF in a ratio of 3:1. In terms of future perspectives, it is suggested a continued optimization of the HCF hydrogels' formation process in order to improve the acquisition of a consistent HCF product in larger amounts, consequently avoiding the need of constant batch preparation and delay of important and further investigation assays. It is also suggested further characterization of the hydrogels, especially in situations of cells incorporation, to determine with certainty the effect of the fabricated 3D environment in cell behavior. In the future, it is intended to achieve a better usage of the 3D biomimetic models’ potential for the repair and regeneration of tissues, as well as the understanding and cure of pathologies; as in specific, the results obtained are expected to contribute to the development of neuronal and vascular biomimetic models, either singular or combined, for in vitro studies and regenerative applications.
One of the greatest challenges encountered in Tissue Engineering (TE) has been the vascularization and innervation of tissues, which allow the medium to long-term functioning of the tissues/ organs. To address this challenge, the goal of this thesis was to optimize the characteristics of a material, involving the conjugation of heparin to fibrin and inclusion of pNIPAM micro-channels in a hydrogel for neural and vascular applications. Improvement of pre-existing hydrogels and the addition of microchannels may promote suitable supports for neural and vascular TE. Experiments towards the optimization and characterization of heparin-conjugated fibrin (HCF) hydrogels (with gelation kinetics study, alcian blue staining, heparin quantification and VEGF-A release profile), tenocytes seeding to test cell behavior, and fabrication of pNIPAM microfibers for hydrogel microchanneling were conducted. It was observed that it was possible to activate and bind heparin to fibrinogen. It was also observed that the gelation time of the hydrogels increases with increasing concentration of fibrin conjugated with heparin. Polymerization difficulties were observed when using 40%, 50%, 75% and 100% HCF concentration. Through dimethylmethylene blue dye and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assays, heparin and VEGF-A growth factor were quantified within the gel and delivered in 5-7 days. It was observed that the hydrogels can retain either heparin or VEGF-A. In the 2D and 3D studies of tenocyte incorporation in HCF hydrogels, cell adhesion was observed in hydrogels at concentrations of 10%, 35% and 50% of HCF. The best diameter and fiber alignment configurations were obtained by electrospinning with 50% pNIPAM fibers in chloroform/ DMF in a ratio of 7:3, as well as 40% pNIPAM in chloroform/ DMF in a ratio of 3:1. In terms of future perspectives, it is suggested a continued optimization of the HCF hydrogels' formation process in order to improve the acquisition of a consistent HCF product in larger amounts, consequently avoiding the need of constant batch preparation and delay of important and further investigation assays. It is also suggested further characterization of the hydrogels, especially in situations of cells incorporation, to determine with certainty the effect of the fabricated 3D environment in cell behavior. In the future, it is intended to achieve a better usage of the 3D biomimetic models’ potential for the repair and regeneration of tissues, as well as the understanding and cure of pathologies; as in specific, the results obtained are expected to contribute to the development of neuronal and vascular biomimetic models, either singular or combined, for in vitro studies and regenerative applications.
Description
Trabalho final de mestrado para obtenção do grau de mestre em Engenharia Biomédica
Keywords
Engenharia de tecidos Tissue Engineering fibrina fibrin heparina heparin hidrogel hydrogel electrospinning
Citation
RAMALHO, Jéssica Reais - Heparin functionalization of fibrin hydrogels for tissue engineering. Lisboa: Instituto Superior de Engenharia de Lisboa - Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa, 2017. Dissertação de mestrado.
Publisher
Instituto Superior de Engenharia de Lisboa - Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa