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Publication
The role of microtubules in bouton initiation and outgrowth
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Authors
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Abstract(s)
ABSTRACT:
Plasticity is the process through which neurons adapt their shape and function to external stimuli and is a critical process for development, learning, and memory. New findings indicate that the formation of new and immature synaptic structures – ghost boutons (GBs) – in motor neurons of Drosophila melanogaster (D. melanogaster) occurs through a mechanism that has never been reported in neuron remodeling, called blebbing, in response to acute stimuli that replicate conditions of high synaptic activity. It was shown that actin does not contribute to the initiation and outgrowth of new synaptic boutons by blebbing, being actin required in later stages of development like stabilization and maturation of GBs. However, the specific role of other cytoskeleton elements, such as microtubules (MTs), in this process remains poorly understood. Thus, this study aims to characterize the dynamics of MTs in the formation and growth of GBs in D. melanogaster. This study employed genetic manipulation techniques, including knockdown and overexpression of microtubule-binding proteins, and immunohistochemical staining for α- and β-tubulin. Third-instar D. melanogaster larvae were stimulated with a patterned high-potassium and calcium protocol to induce the formation of additional GBs. MT dynamics were further probed using taxol, a stabilizing agent, and vinblastine, a destabilizer, to manipulate MT stability during GB development. The labeling of α- and β-tubulin revealed dynamic changes in MT stability within GBs. Supporting this, taxol treatment led to a significant reduction in GB numbers, yet the remaining GBs were larger and often contained high intensity of the stabilizing protein Futsch, suggesting that MT stabilization may inhibit initial GB formation but promote the growth of mature boutons. Conversely, vinblastine treatment did not significantly alter GB numbers, indicating that complete MT destabilization may interfere with the maturation process, suggesting that a degree of MT stabilization may be required for GB maturation. EB1, a plus-end tracking protein, was present in all GBs possibly indicating its involvement in the initiation of the blebbing process and that MT polymerization may be happening during GB development. Futsch and Short-Stop proteins, which help stabilize MTs, exhibited similar results regarding their presence within GBs and decrease in GB numbers when their expression is reduced, highlighting their roles in promoting GB stability and MT integrity, indicating that they are crucial for the blebbing process. Lastly, the severing protein subunit Katanin-60, played a critical role in bouton development, as reduced levels of Katanin-60 resulted in a decrease in GB numbers, highlighting the importance of controlled MT severing for proper GB formation and maintenance. Thus, our findings highlight the crucial role of MT dynamics in GB formation, suggesting that both MT stabilizers and severing proteins are involved in synaptic plasticity. These findings might provide relevant insights into potential therapeutic approaches for neurodegenerative diseases linked to synaptic dysfunction, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis and Alzheimer’s disease. Future studies, including live imaging, behavioral analysis, and Tau-Spastin compensatory mechanism assessment, are needed to elucidate the exact processes underlying MT involvement in GB formation and outgrowth.
A plasticidade é o processo através do qual os neurónios adaptam a sua forma e função a estímulos externos e é um processo crítico para o desenvolvimento, aprendizagem e memória. Novas descobertas indicam que a formação de novas estruturas sinápticas imaturas – ghost boutons (GBs) – em neurónios motores de Drosophila melanogaster (D. melanogaster) ocorre através de um mecanismo que nunca foi reportado na remodelação neuronal, chamado blebbing, em resposta a estímulos agudos que mimetizam elevada atividade sináptica. Foi demonstrado que a actina não contribui para a iniciação e crescimento do processo de formação de novos botões sinápticos por blebbing sendo necessária em estágios posteriores de desenvolvimento, como a estabilização e maturação dos GBs. No entanto, o papel específico dos outros elementos do citoesqueleto, como os microtúbulos (MTs), neste processo permanecem pouco compreendidos. Assim, este estudo visa caracterizar a dinâmica dos MTs na formação e crescimento de GBs em D. melanogaster. Neste estudo foram usadas técnicas de manipulação genética, incluindo knockdown e sobre-expressão de proteínas de ligação a microtúbulos, e coloração imuno-histoquímica de α- e β-tubulina. Larvas de D. melanogaster no terceiro estadio foram estimuladas com um protocolo intervalado rico em potássio e cálcio para induzir a formação de GBs adicionais. Para explorar melhor a dinâmica dos MTs foi utilizado o taxol, um agente estabilizador, e a vinblastina, um desestabilizador, para manipular a estabilidade dos MTs durante o desenvolvimento dos GBs. A marcação de α- e β-tubulina revelou mudanças dinâmicas na estabilidade dos MTs dentro dos GBs. Não obstante, o tratamento com taxol levou a uma redução significativa no número de GBs, no entanto, os GBs remanescentes eram maiores e continham frequentemente uma alta intensidade da proteína estabilizadora Futsch, sugerindo que a estabilização dos MTs pode inibir a formação inicial dos GBs, mas promover o crescimento de botões maduros. Por outro lado, o tratamento com vinblastina não alterou significativamente o número de GBs, indicando que a desestabilização completa dos MTs pode interferir com o processo de maturação, sugerindo que um certo grau de estabilização dos MTs pode ser necessário para a maturação dos GBs. EB1, uma proteína que associada ao extremo positivo dos MTs, estava presente em todos os GBs, o que provavelmente aponta para o seu envolvimento na iniciação do processo de blebbing e que a polimerização dos MTs pode estar a ocorrer durante o desenvolvimento dos GBs. As proteínas Futsch e Short-Stop, que ajudam a estabilizar os MTs, exibiram resultados semelhantes em relação à sua presença nos GBs e à diminuição do número de GBs quando a sua expressão foi reduzida, destacando os seus papéis na promoção da estabilidade dos GBs e na integridade dos MTs, indicando que são cruciais para o processo de blebbing. Por fim, a subunidade da proteína de clivagem Katanin-60 desempenhou um papel crítico no desenvolvimento dos botões, uma vez que níveis reduzidos de Katanin-60 resultaram numa diminuição do número de GBs, sublinhando a importância da fragmentação controlada dos MTs para a formação e manutenção adequadas dos GBs. Assim, as nossas descobertas destacam o papel crucial da dinâmica dos MTs na formação dos GBs, sugerindo que tanto os estabilizadores dos MTs como as proteínas de clivagem estão envolvidos na plasticidade sináptica. Estas descobertas podem fornecer informações relevantes sobre possíveis abordagens terapêuticas para doenças neuro-degenerativas ligadas à disfunção sináptica, como a Esclerose Lateral Amiotrófica e a Doença de Alzheimer. Estudos futuros, incluindo live imaging e análise comportamental, bem como a avaliação do mecanismo compensatório entre Tau-Spastin, são necessários para elucidar os processos exatos subjacentes ao envolvimento dos MTs na formação e crescimento dos GBs.
A plasticidade é o processo através do qual os neurónios adaptam a sua forma e função a estímulos externos e é um processo crítico para o desenvolvimento, aprendizagem e memória. Novas descobertas indicam que a formação de novas estruturas sinápticas imaturas – ghost boutons (GBs) – em neurónios motores de Drosophila melanogaster (D. melanogaster) ocorre através de um mecanismo que nunca foi reportado na remodelação neuronal, chamado blebbing, em resposta a estímulos agudos que mimetizam elevada atividade sináptica. Foi demonstrado que a actina não contribui para a iniciação e crescimento do processo de formação de novos botões sinápticos por blebbing sendo necessária em estágios posteriores de desenvolvimento, como a estabilização e maturação dos GBs. No entanto, o papel específico dos outros elementos do citoesqueleto, como os microtúbulos (MTs), neste processo permanecem pouco compreendidos. Assim, este estudo visa caracterizar a dinâmica dos MTs na formação e crescimento de GBs em D. melanogaster. Neste estudo foram usadas técnicas de manipulação genética, incluindo knockdown e sobre-expressão de proteínas de ligação a microtúbulos, e coloração imuno-histoquímica de α- e β-tubulina. Larvas de D. melanogaster no terceiro estadio foram estimuladas com um protocolo intervalado rico em potássio e cálcio para induzir a formação de GBs adicionais. Para explorar melhor a dinâmica dos MTs foi utilizado o taxol, um agente estabilizador, e a vinblastina, um desestabilizador, para manipular a estabilidade dos MTs durante o desenvolvimento dos GBs. A marcação de α- e β-tubulina revelou mudanças dinâmicas na estabilidade dos MTs dentro dos GBs. Não obstante, o tratamento com taxol levou a uma redução significativa no número de GBs, no entanto, os GBs remanescentes eram maiores e continham frequentemente uma alta intensidade da proteína estabilizadora Futsch, sugerindo que a estabilização dos MTs pode inibir a formação inicial dos GBs, mas promover o crescimento de botões maduros. Por outro lado, o tratamento com vinblastina não alterou significativamente o número de GBs, indicando que a desestabilização completa dos MTs pode interferir com o processo de maturação, sugerindo que um certo grau de estabilização dos MTs pode ser necessário para a maturação dos GBs. EB1, uma proteína que associada ao extremo positivo dos MTs, estava presente em todos os GBs, o que provavelmente aponta para o seu envolvimento na iniciação do processo de blebbing e que a polimerização dos MTs pode estar a ocorrer durante o desenvolvimento dos GBs. As proteínas Futsch e Short-Stop, que ajudam a estabilizar os MTs, exibiram resultados semelhantes em relação à sua presença nos GBs e à diminuição do número de GBs quando a sua expressão foi reduzida, destacando os seus papéis na promoção da estabilidade dos GBs e na integridade dos MTs, indicando que são cruciais para o processo de blebbing. Por fim, a subunidade da proteína de clivagem Katanin-60 desempenhou um papel crítico no desenvolvimento dos botões, uma vez que níveis reduzidos de Katanin-60 resultaram numa diminuição do número de GBs, sublinhando a importância da fragmentação controlada dos MTs para a formação e manutenção adequadas dos GBs. Assim, as nossas descobertas destacam o papel crucial da dinâmica dos MTs na formação dos GBs, sugerindo que tanto os estabilizadores dos MTs como as proteínas de clivagem estão envolvidos na plasticidade sináptica. Estas descobertas podem fornecer informações relevantes sobre possíveis abordagens terapêuticas para doenças neuro-degenerativas ligadas à disfunção sináptica, como a Esclerose Lateral Amiotrófica e a Doença de Alzheimer. Estudos futuros, incluindo live imaging e análise comportamental, bem como a avaliação do mecanismo compensatório entre Tau-Spastin, são necessários para elucidar os processos exatos subjacentes ao envolvimento dos MTs na formação e crescimento dos GBs.
Description
The present study is part of an approved research project entitled “Muscle-Neuron-Glia Interactions in 3D: Contribution of Mechanical Forces and Signaling to Synaptic Structure and Function” that has as primary researcher Dr. Rita Teodoro (Neuronal Growth and Plasticity Laboratory principal investigator), funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (Reference: PTDC-01778/2022- NeuroDev3D). Given that the researcher is integrated into the Neuronal Growth and Plasticity research group at NOVA Medical School - Research all laboratory work was developed and carried out with the support of the referred laboratory, so all the material and reagents required for the achievement of this research were provided by it.
Mestrado em Tecnologias Clínico-Laboratoriais
Mestrado em Tecnologias Clínico-Laboratoriais
Keywords
Synaptic plasticity Drosophila melanogaster Neuromuscular junction Ghost boutons Microtubules Plasticidade sináptica Junção neuromuscular Microtúbulos MTCL
Citation
Neves AC. The role of microtubules in bouton initiation and outgrowth [dissertation]. Lisboa: Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa/Instituto Politécnico de Lisboa; 2024.
Publisher
Instituto Politécnico de Lisboa