ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado
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Browsing ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado by advisor "Brito, Miguel"
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- Efeitos dos extratos de Carica papaya na regulação transcricional e pós-transcricional da hemoglobina fetalPublication . Canteiro, Beatriz da Silva Malainho; Brito, Miguel; Gomes, Anita QuintalIntrodução: As hemoglobinopatias constituem um dos grupos de doenças monogénicas mais comuns no mundo. Atualmente, um dos tratamentos disponíveis consiste na indução farmacológica da hemoglobina fetal (HbF) através de vários compostos químicos, sendo o mais comum a hidroxiureia (HU). Contudo, o seu custo elevado em países subdesenvolvidos e o seu perfil de segurança limitam a utilização deste composto. Assim, é essencial a descoberta de novos compostos indutores de HbF com menos efeitos secundários e que sejam de fácil acesso, como é o caso dos compostos naturais (ex: Extrato de folha de Carica papaya L. e Quercetina). Objetivo: Avaliar o efeito do extrato metanólico das folhas de Carica papaya L. (EMFCP) e da Quercetina em células K562 (linha celular humana mortalizada de leucemia mielóide) ao nível da expressão dos genes HBG1 e HBG2, bem como de genes reguladores. Material e Métodos: A linha celular K562 foi exposta durante 24 horas ao EMFCP (0,5; 50 e 100 μg/mL) à Quercetina (0,2 e 20 μM) e à HU (25 μg/mL). Após a exposição aos compostos naturais quantificaram-se os efeitos da expressão génica a partir do RNA total, tendo-se recorrido à técnica de RT-qPCR. Analisaram-se os níveis de expressão dos genes das globinas (HBA, HBB, HBG1 e HBG2); genes reguladores da HbF (MYB, KLF1, BCL11A e BGLT3), para além de miRNAs envolvidos na regulação da HbF (miR-486-3p, miR-34a-5p, miR-210-5p, miR-32-5p e miR-96-5p), tendo como referências endógenas o GAPDH para os genes codificantes e o miR-426-3p para os miRNAs analisados. Resultados: A proliferação celular é afetada pela Quercetina a 20 μM, ao contrário da viabilidade que não é afetada por nenhum dos compostos nas concentrações estudadas. Através da análise transcricional, demonstrou-se que o EMFCP e a Quercetina apresentam efeitos opostos nos padrões de expressão dos genes HBB, MYB e KLF1, sugerindo-se que estes atuem por diferentes mecanismos de ação. Estes compostos também modulam a expressão de alguns miRNAs estudados, havendo uma correlação inversa, para algumas das concentrações utilizadas, com os valores de expressão dos potenciais genes alvo. Conclusão: O presente estudo preliminar sugere que o EMFCP e a Quercetina modulam a expressão da HbF, dos genes e de miRNAs reguladores em determinadas concentrações, constituindo assim uma potencial abordagem eficaz na terapêutica das β-hemoglobinopatias.
- Natural compounds with the capacity to reactivate the gene of gamma-globin and induction of fetal hemoglobin - In vitro testPublication . Matos, Elisabete Cristina Conceição de; Brito, Miguel; Ribeiro, Edna Soraia Gregórioβ-hemoglobinopathies are the most common recessive genetic diseases worldwide. Currently available treatments for these disorders are expensive and associated with severe side effects. Pharmacological reactivation of Fetal Hemoglobin (HbF) is seen as a promising therapeutic strategy. Hydroxyurea (HU), a potent ribonucleotide reductase inhibitor, is the only Food and Drug Administration (FDA) approved HbF inducing agent. However, its cytotoxicity, potential carcinogenicity and variable clinical effects limit severely its use. Identification of novel agents, with higher HbF inducing activity, lower cytotoxicity and available in low-income countries, such as natural compounds, has become a great challenge today. Here, we performed an assessment of potential transcriptional effects induced by two natural bioactive compounds, namely Genistein (GN) a naturally occurring flavonoid found in soybean and soy derivates and Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) the major polyphenol component of green tea, in globin and HbF regulators/silencer genes. K562 cell line was exposed for 72 and 96 hours to three different concentrations of GN and EGCG that mimic cellular exposure in vivo after supplementation (100 ƞg/ml, 250 ƞg/ml and 500 ƞg/ml), and 25 μg/ml HU was used as a positive control. Cell viability and proliferation were measured and the transcriptional effects of GN and EGCG on α, β and γ-globin genes, as well as the HbF regulators genes BCL11A and KLF1, were evaluated by qRT-PCR using specific primers. Our results demonstrated that both compounds impact cellular metabolism and proliferation with no cytotoxic effects and have a potential specific molecular target for BCL11A with associated downregulation, without altering KLF1 levels. GN and EGCG also affected globin expression levels in a dose and time-dependent manner. Interestingly, transcriptional analysis of both compounds revealed non-monotonic dose-responses (NMDRs). Overall, our preliminary study sustains the potential of these compounds for γ-globin reactivation and consequently HbF induction, which indicates that GN and EGCG may be potential candidates for new therapeutic strategies. Further research must be performed in order to assess the effectiveness of HbF induction and the underlying molecular mechanisms.
- Oxitocina e saúde mental em estudantes do ensino superiorPublication . Veríssimo, Ana Carolina Escrevente; Brito, Miguel; Veiga, LuísaO aumento de prevalência de perturbações do foro psicológico em estudantes universitários tem sido referido por vários autores e o papel dos aspetos biológicos no seu desenvolvimento tem ganho preponderância. Destes salienta-se a oxitocina e o temperamento, característica individual com base biológica. Apesar de resultados ainda pouco conclusivos, vários estudos têm mostrado que a oxitocina desempenha um papel importante numa panóplia de comportamentos sociais que tem um papel relevante no desenvolvimento de muitas psicopatologias. Até à data, do nosso conhecimento, não existem estudos que relacionem a oxitocina com perturbações psicológicas e o temperamento. Assim, com este projeto pretendeu-se estudar a relação entre os níveis plasmáticos de oxitocina e de dois polimorfismos no gene do seu recetor com perturbações da saúde mental (nomeadamente ansiedade e depressão) e temperamento em estudantes do ensino superior. Para isso foram aplicados questionários a uma amostra de 762 estudantes do Instituto Politécnico de Lisboa. Para além do questionário demográfico, foram usados os questionários: Depressão de Beck (BDI), Temperamento do Adulto (ATQ) e Ansiedade de traço (STAI-Y2). Posteriormente desses foram selecionados aleatoriamente estudantes para participarem na segunda parte do projeto que consistia na determinação dos níveis de oxitocina pelo método de ELISA bem como os polimorfismos genéticos do seu recetor através de PCR em tempo real. No que se refere ao perfil de saúde mental dos estudantes, verificou-se que a maioria dos estudantes têm níveis de ansiedade normais (68,4%) e não manifestam perturbações depressivas (61,8%), sendo as raparigas que apresentam valores mais elevados nos casos de depressão. Quanto ao temperamento, é a escala da sensibilidade orientadora que tem maior expressão entre os estudantes (43,6%). Em relação aos níveis de oxitocina, verificou-se que são tendencialmente mais baixos para níveis de ansiedade e de depressão mais elevados. Não foram detetadas diferenças estatisticamente significativas quando comparados com os polimorfismos genéticos, contudo verificou-se que há uma tendência para os indivíduos heterozigóticos GA terem maiores níveis desta hormona. Das relações estudadas entre o temperamento e os níveis de oxitocina, aquela que se salientou foi na escala do controlo de esforço, a subescala do controlo de ativação. Estes resultados suportam a existência de uma relação entre o temperamento, as perturbações de saúde mental estudadas e os níveis de oxitocina sugerindo-se que a oxitocina possui um papel protetor neste mecanismo. Este facto, pode suportar a hipótese de utilização de oxitocina exógena no tratamento ou prevenção destas perturbações psicológicas. Contudo, mais estudos são necessários neste âmbito.
- A utilização da "Next-Genaration Sequencing" no estudo da obesidade monogénicaPublication . Serrasqueiro, Bernardo Afonso; Brito, Miguel; Veiga, LuísA obesidade é uma epidemia que tem vindo a afetar cada vez mais os países industrializados. Esta é uma condição clinica com uma componente genética que aos poucos vai sendo descodificada onde as tecnologias de NGS dão um grande contributo. Neste trabalho, são analisadas amostras provenientes de 36 pacientes obesos que apartir de uma amostra de células do epitélio bucal foi efectuada uma extracção de DNA e feita uma análise em NGS com o objectivo de procurar variantes num painel de genes associados à obesidade. Foram obtidas 183 variantes snv, 2 inserções e 1 delecção, sendo 141 destas heterozigóticas. Foram identificadas duas mutações missense ainda não descritas para os genes LRP2 12385A>G e SORCS1 2491A>C. Foram ainda identificadas 2 amostras com mutações possivelmente danosas, segundo a previsão polyphen, para o gene POMC. A tecnologia NGS representa assim um equipamento com potencial não só para auxilio e confirmação de diagnósticos clínicos, como também abre a porta para estratégias de tratamento personalizáveis.