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Abstract(s)
ABSTRACT - Colorectal Cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. In patients with advanced CRC, standard treatment strategies have shown low effectiveness. Adoptive Cell Therapy (ACT) is an immunotherapy approach that relies on the use of autologous T-cells to target tumour cells. More recently, Natural Killer (NK) cells have appeared as an alternative to T-cells due to their lesser secondary effects, strong cytotoxicity, and tumour microenvironment (TME) regulatory capacity. The main goal of this project is to evaluate the immune infiltrates in CRC tissue specimens, with a focus on NK cells, using multiplex immunofluorescence (Mplex IF). Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumour specimens from 10 patients who underwent surgery for CRC were used to characterise the TME. Multispectral microscopy was used to quantify and analyse the spatial distribution of NK cells, their subtypes and functionality, using antibodies from different animal sources. After initial Mplex optimization, regions of interest were acquired for each specimen using a Nikon 90i fluorescence microscope with a multispectral camera. The images were generated with the Nuance software and later analysed using the Fiji/ ImageJ software. To evaluate the activation state of NK cells in the CRC TME Mplex was developed, with the following biomarkers: NCAM1 (NK Cells), CD16 (cytotoxic NK cells), NKG2D (activated NK cells), CD3 (T cells) and Pan-Cytokeratin which was used to label the tumour cells to localize the immune cells with respect of the neoplastic glands. Different tumour compartments: stroma on the periphery of the tumour, stroma between the tumour glands and intraepithelial were analysed and correlated with clinicopathological patient characteristics. The results obtained demonstrate that NK cells there was a significant association between a high number of NK cells a low stages of tumour progression. Notably, a lower number of infiltrating NK cells CRC is associated with a higher risk of mortality.
RESUMO - O Cancro Colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais comum em todo o mundo. Em doentes com CCR avançado, as estratégias de tratamento padrão têm pouca eficácia. A Terapia Celular Adotiva (ACT) é uma abordagem de imunoterapia que se baseia na utilização de células T autólogas para atingir as células tumorais. Mais recentemente, as células Natural Killer (NK) têm surgido como uma alternativa às células T devido aos seus menores efeitos secundários, forte citotoxicidade e capacidade reguladora do microambiente tumoral (TME). O principal objetivo deste projeto é avaliar os infiltrados imunitários em amostras de tecido de CCR, com foco nas células NK, utilizando imunofluorescência multiplex (Mplex IF). Neste trabalho, foram utilizadas amostras de tumores fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) para caracterizar o TME de 10 doentes submetidos a cirurgia de CCR. A microscopia multiespectral foi utilizada para quantificar e analisar a distribuição espacial das células NK, os seus subtipos e a função, utilizando anticorpos de diferentes origens animais. Após a otimização inicial da Mplex, foram adquiridas regiões de interesse para cada amostra utilizando um microscópio de fluorescência Nikon 90i com uma câmara multiespectral. As imagens foram geradas com o software Nuance e posteriormente analisadas com o software Fiji/Image J. Para avaliar o estado de ativação das células NK no TME do CCR, foi desenvolvida uma Mplex com os seguintes biomarcadores NCAM1 (células NK), CD16 (células NK citotóxicas), CD3 (células T), NKG2D (células NK ativadas) e a Pan-Citoqueratina que foi utilizada para marcar as células tumorais de modo a localizar as células imunitárias em relação às glândulas neoplásicas. Diferentes compartimentos tumorais foram analisados, nomeadamente o estroma na periferia do tumor, o estroma entre as glândulas tumorais e intra-epitelial e correlacionados com as características clinicopatológicas dos pacientes. Os resultados obtidos demostram que existe uma associação significativa entre o elevado número de células NK e baixos estádios de progressão do tumor. Nomeadamente, um menor número de células NK infiltradas no CCR está associado a um maior risco de mortalidade.
RESUMO - O Cancro Colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais comum em todo o mundo. Em doentes com CCR avançado, as estratégias de tratamento padrão têm pouca eficácia. A Terapia Celular Adotiva (ACT) é uma abordagem de imunoterapia que se baseia na utilização de células T autólogas para atingir as células tumorais. Mais recentemente, as células Natural Killer (NK) têm surgido como uma alternativa às células T devido aos seus menores efeitos secundários, forte citotoxicidade e capacidade reguladora do microambiente tumoral (TME). O principal objetivo deste projeto é avaliar os infiltrados imunitários em amostras de tecido de CCR, com foco nas células NK, utilizando imunofluorescência multiplex (Mplex IF). Neste trabalho, foram utilizadas amostras de tumores fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) para caracterizar o TME de 10 doentes submetidos a cirurgia de CCR. A microscopia multiespectral foi utilizada para quantificar e analisar a distribuição espacial das células NK, os seus subtipos e a função, utilizando anticorpos de diferentes origens animais. Após a otimização inicial da Mplex, foram adquiridas regiões de interesse para cada amostra utilizando um microscópio de fluorescência Nikon 90i com uma câmara multiespectral. As imagens foram geradas com o software Nuance e posteriormente analisadas com o software Fiji/Image J. Para avaliar o estado de ativação das células NK no TME do CCR, foi desenvolvida uma Mplex com os seguintes biomarcadores NCAM1 (células NK), CD16 (células NK citotóxicas), CD3 (células T), NKG2D (células NK ativadas) e a Pan-Citoqueratina que foi utilizada para marcar as células tumorais de modo a localizar as células imunitárias em relação às glândulas neoplásicas. Diferentes compartimentos tumorais foram analisados, nomeadamente o estroma na periferia do tumor, o estroma entre as glândulas tumorais e intra-epitelial e correlacionados com as características clinicopatológicas dos pacientes. Os resultados obtidos demostram que existe uma associação significativa entre o elevado número de células NK e baixos estádios de progressão do tumor. Nomeadamente, um menor número de células NK infiltradas no CCR está associado a um maior risco de mortalidade.
Description
Mestrado em Tecnologias Clínico-Laboratoriais
Keywords
Colorectal cancer Natural killer cells Tumour microenvironment Immunofluorescence Multispectral microscopy Biomarkers Cancro colorretal Células natural killer Microambiente tumoral Imunofluorescência Microscopia multiespectral Biomarcadores
Citation
Calá HA. Characterization of the colon adenocarcinoma microenvironment with a focus on natural killer cells [dissertation]. Lisboa: Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa/Instituto Politécnico de Lisboa; 2023.
Publisher
Instituto Politécnico de Lisboa, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa