ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado
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Percorrer ISEL - Engenharia Biomédica - Dissertações de Mestrado por orientador "Brito, Rui Miguel Duque de"
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- Análise da expressão de microRNA moduladores da hemoglobina fetal em células expostas a extratos de Carica papayaPublication . Jacques, Filipa Carvalhao; Gomes, Anita Quintal; Brito, Rui Miguel Duque deIntrodução: As hemoglobinopatias são doenças sanguíneas genéticas resultantes de mutações e genes que codificam a hemoglobina, que perturbam o transporte de oxigénio e conduzem a diversas complicações de saúde. Para fazer face a estes desafios, é necessário aumentar os níveis de hemoglobina fetal (HbF) como abordagem terapêutica, mas o principal tratamento, a hidroxiureia (HU), enfrenta limitações relacionadas com o custo e a segurança, especialmente em países subdesenvolvidos. Para ultrapassar estas limitações, os investigadores estão a estudar alternativas naturais, como os extratos de folhas de Carica papaya, para aumentar a produção de HbF, esta abordagem natural promete minimizar os efeitos secundários indesejáveis associados aos tratamentos convencionais como a hidroxiureia. Objetivo: Avaliar o efeito de diferentes concentrações dos extratos metanólicos e aquosos nas folhas de Carica papaya em células K562 (linha celular humana mortalizada de leucemia mieloide) para avaliar o seu impacto na regulação da HbF Material e Métodos: Foi realizada uma investigação comparativa, na qual foram avaliados os efeitos de extratos aquosos e metanólicos derivados das folhas de Carica papaya (EMFCP e EAFCP, respetivamente) na indução da HbF e seus genes reguladores, tendo-se usado a exposição a HU como controlo positivo. As células K562 foram expostas a um período 24 horas a concentrações variáveis de EMFCP e EAFCP (0,05, 0,5 e 5 μg/mL). Após a exposição foram avaliados os efeitos da expressão génica a partir do RNA total, recorrendo à técnica de RT-qPCR. Analisaram-se os níveis de expressão dos genes das globinas (HBA, HBB e HBG1); genes reguladores da HbF (BCL11A, HIC2 e BGLT3), assim como os moduladores epigenéticos da globina (DNMT1, DNMT3B, HDAC1, HDAC2, HDAC3 e HDAC8), tendo como gene de referência o GAPDH. Foram ainda analisados os miRNAs envolvidos na regulação da HbF (miR-30a-3p, miR-29c-3p e o miR-148b-3p), tendo como referência o miR- miRNA-423-3p. Resultados: A proliferação celular e a viabilidade das células K562 permaneceram inalteradas em todas as concentrações para todos os compostos testados. Os compostos estudados não apresentam sinais de citotoxicidade. A análise transcricional revelou efeitos opostos aos esperados aquando da exposição, ao EMFCP (0,05 μg/mL e 0,5 μg/mL), uma vez que há uma regulação negativa dos genes das hemoglobinas, como observado nos perfis de expressão dos genes HBA e HBB e a indução da expressão do gene inibidor da HbF, o BCL11A. Estes resultados são reproduzidos em células expostas ao EAFCP (à concentração de 0,5 μg/mL) onde também se verifica o aumento da expressão deste regulador negativo da expressão da HbF, o BCL11A. Estes compostos exibiram também efeitos reguladores importantes sobre a expressão de miRNAs específicos, nomeadamente o miR-29c-3p e o miR-148b-3p. A expressão do miR-29c-3p diminuiu com a exposição ao EMFCP, EAFCP e HU, enquanto os seus genes alvo – o BCL11A e o DNMT3B – a sua expressão aumentou. A expressão do miR-148b-3p diminui quando exposto ao EMFCP, enquanto a do seu gene alvo, BCL11A aumentou, alinhando-se com o papel regulador negativo do miRNA. Conclusão: Este estudo introduz uma nova perspetiva sobre os compostos naturais como moduladores da HbF. Os resultados observados, envolvendo alterações nos genes reguladores da HbF, são promissores para investigação futura acerca de terapias da hemoglobina com base em compostos naturais.
- Caracterização das variantes de hemoglobina encontradas durante um programa de rastreio neonatal de anemia das células falciformes em AngolaPublication . Estopa, Rita Isabel Paulo; Brito, Rui Miguel Duque deAs hemoglobinopatias consistem num grupo heterogéneo de doenças genéticas, tendo uma elevada prevalência global, particularmente em África, destacando-se a Anemia das Células Falciformes (ACF) e as Talassemias. Em Angola, apesar de ser conhecida a elevada prevalência de ACF, a diversidade genética das variantes de hemoglobina permanece pouco caracterizada, limitando o desenvolvimento de estratégias de rastreio e de intervenção médica. Tem sido, ao longo dos anos, comprovado o importante papel do rastreio neonatal na redução da mortalidade infantil associada a hemoglobinopatias. Esta dissertação teve como objetivo caracterizar molecularmente as variantes de hemoglobina detetadas durante um Programa de Rastreio Neonatal de ACF, contribuindo para o conhecimento epidemiológico no país. Foram analisadas por Focagem Isoelétrica (IEF) 13 256 amostras de recém-nascidos, tendo-se selecionado 45 dessas amostras, que demonstraram perfis eletroforéticos atípicos, para análises moleculares complementares, nomeadamente PCR-RFLP, Gap-PCR e sequenciação de Sanger. Foram confirmadas variantes estruturais de elevada prevalência, como HbS e HbC, bem como variantes menos expectáveis, como HbE, sugerindo fenómenos de ancestralidade ou migração. Os resultados revelaram que 26,7% das amostras atípicas apresentavam genótipo AS, 17,8% genótipo AC, 2,2% genótipo AE e 2,2% genótipo SS, permanecendo 51,1% inconclusivas, sobretudo devido a limitações técnicas, fraca qualidade do DNA extraído de sangue seco e dificuldades na amplificação dos genes HBA. Foram ainda detetados SNPs reportados como benignos (rs10768683 e rs713040), mas cuja relevância clínica demonstra carecer de investigação adicional. Este estudo reforça a importância da combinação de métodos fenotípicos e moleculares para a confirmação diagnóstica de hemoglobinopatias, especialmente em contextos de elevada diversidade genética. A identificação de variantes inesperadas sublinha a necessidade de abordagens diagnósticas mais abrangentes, contemplando fenómenos migratórios e uma gama mais alargada de hemoglobinopatias. Os dados obtidos fornecem suporte científico para a consolidação e otimização de programas de rastreio neonatal em Angola, com potencial aplicabilidade em outros contextos africanos.